畢赤酵母表達與純化

畢赤酵母表達與純化服務

服務描述:

畢赤酵母蛋白表達系統是一種最經濟高效的真核蛋白表達系統,可以成功實現胞內表達或是分泌表達,且其放大培養基相對廉價,培養條件要求不高,適宜工業放大。與哺乳動物細胞表達系統一樣,畢赤酵母蛋白表達系統能夠對所表達蛋白進行例如糖基化、酰基化、脂基化、磷酸基化等修飾保證蛋白天然構象的修飾,可用于制備非常接近天然蛋白的具有高附加值的蛋白原料。
   
我們的畢赤酵母蛋白表達平臺由多年從事酵母表達操作的實驗人員組成,經驗豐富,采用自行改造的高效分泌載體和宿主組合,可在最大程度上實現最高質量的蛋白表達。經客戶反饋,以我平臺所制備的蛋白原料為抗原所制備的單抗均具有很好的識別天然蛋白的優良特性。

眾紅優勢:

采用自行改造的高效分泌載體:pPIC9KpPIC3.5K,高效融合載體pPICZαpGAPZα與宿主GS115KM71X33的正交組合。PINK系統優化分泌表達信號肽。胞內表達采用自行改造的載體pPIC 3.5K載體和宿主GS115KM71X33的組合,可在最大程度上實現表達。

高效的種子篩選工作能使您所定制的蛋白在最短的時間內獲得盡可能高的產量。

具體內容:

服務步驟

主要內容

交付內容

交付時間

目的基因全基因合成

1. 從GenBank中尋找目的蛋白的cDNA序列。
2. 根據選用的表達系統對cDNA進行密碼子及mRNA二級結構的優化。
3. 合成設計好的基因序列。

目的基因(連接在T載體或其它常規克隆載體上)及測序報告。

3-4周

目的基因亞克隆

1. 培養并提取含有目的基因的表達載體。
2. 將目的基因亞克隆到合適的表達載體上。
3. 測序驗證構建表達載體的準確性。
4. 可提供表達載體(pPICZα為主)。

正確構建的重組表達質粒,含重組質粒的DH5α菌株及測序報告。

2-3周

畢赤酵母表達菌株電轉化

1. 酶切線性化表達載體。
2. 將表達載體通過電轉化到高效的畢赤酵母表達菌株中。
3. 通過PCR或者表達產物鑒定挑選至少5個陽性克隆。
4.可提供不同表型的表達菌株。

PCR陽性克隆及PCR結果報告

2周

畢赤酵母表達菌株篩選

1. 將5個陽性克隆于BMGY培養基中擴增,然后更換至BMMY培養基中,并加入甲醇誘導表達目的蛋白。
2. SDS-PAGE電泳檢測培養上清中目的蛋白的表達情況,并挑選合適的單克隆菌株用于目的蛋白的表達
3. 如果培養上清中檢測不到表達,則通過將上清濃縮20倍作用再檢測,或通過Western-blot方法檢測目的蛋白表達(客戶需要提供相關抗體)。

陽性克隆菌株及表達篩選結果報告。

2

畢赤酵母表達菌株表達優化

1. 挑選20個陽性克隆進行常規表達篩選,并對其中表達最好菌株優化表達條件。
2. 對挑選出來的單克隆菌株,優化培養及誘導條件(培養基,菌體密度,甲醇濃度,誘導時間等),提高目的蛋白的表達量。

三個陽性克隆菌株及優化表達條件結果報告。

2周

目的蛋白表達及純化

1. 搖瓶培養1L重組酵母菌,誘導表達目的蛋白。.
2. 通過親和,離子,疏水及凝膠過濾等多種層析方法純化表達的重組蛋白。
3. 通過SDS-PAGE電泳檢測每步純化結果并控制最終產品質量。
4. 通過Western-blot驗證目標蛋白正確性。

純化好的目的蛋白1~10mg及純化報告。可按客戶要求提供含純化標簽(Tag)或切除純化標簽(Tag)的最終蛋白,純度可達80%以上。

2-3周

目的蛋白的再加工及詳細檢測

1. 內毒素去除,除菌,凍干等進一步加工。
2. 通過HPLC等方法詳細檢測目的蛋白的質量。

加工后的終產品及相關實驗和檢測報告

2周

大規模制備

按照小試工藝放大生產規模,5L~30L高密度發酵并制備客戶需要的合格蛋白產品。

合格的目的蛋白及服務報告

協商


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